什麼是生物大分子的散射技術

當可見光、電子束、X射線及中子輻射在含有生物大分子的非均一介質中傳播時，能使這些大分子產生散射輻射。通過測量這些散射輻射的強度或頻率，可以推算生物大分子的分子量、大小、體積、形狀、結構及運動等性質。這種測量技術稱為生物大分子的散射技術。由於入射線的種類不同，它們與生物大分子相互作用的性質不同，這項技術又可分為彈性光散射、動態光散射、喇曼（Raman）散射以及X射線和中子的小角散射技術等。它們主要用於測量生物大分子的溶液樣品。其中喇曼散射和中子散射可以用來測量任何狀態的樣品，包括晶體、溶液及活細胞的組分等。

彈性光散射

散射光與入射光波長相同的散射，也稱為瑞利(Rayleigh)散射。度量散射光與入射光的相對強度的物理量稱為瑞利比（

），它與散射角(θ)有關。按照溶液中分子大小程度不同，這種散射又可分為兩種情況：

（1）當分子大小的量級(線度)比入射光的波長小很多時，它們在溶液中都是獨立的散射子。此時散射光的相對強度與分子量(M)成正比關係：

，其中C為樣品濃度，K為比例常數。因此可由測定樣品不同濃度的瑞利比，採用外推作圖法求得分子量。

（2）當溶液中分子的線度與入射光的波長量級相同時，需要考慮分子的幾何形狀以及分子內各部分散射光之間的相干效應。為此引入表示分子大小的物理量，稱為回轉半徑(Rg)。它的定義是分子中各原子對於分子重心距離的均方根值。此時散射光的相對強度是樣品濃度和散射角的函數。採用齊姆（Zimm）作圖法可以求得大分子的分子量和回轉半徑。圖示

腹水腫瘤細胞tRNA分子光散射的齊姆圖。圖中對應C＝0，θ＝0兩條外推曲線的交點即為縱座標的截距1/M，相當於獨立分子散射的情況。從C＝0外推曲線的斜率可以求得回轉半徑。

動態光散射

溶液中生物大分子準彈性散射的一種類型。由於生物大分子在溶液中實際上不斷地作擴散運動，或存在如構象變化，聚合或解離等動態行為，使得散射光的頻率和相位隨時間變化。這種頻移屬於多普勒效應的性質，可由散射頻譜分析法或延遲訊號的自相關分析法測定。這種技術可用來測定大分子在溶液中的擴散係數。它與分子的大小、形狀有關，從而可以推算大分子的半徑。如球狀分子的擴散係數D＝KT/6πηa，其中K為玻爾茲曼常數，T為温度，η為粘度，a為分子的有效半徑。

喇曼散射

生物大分子的非彈性散射類型。當樣品受到激光照射時，絕大部分散射光的頻率與入射光相同。這就是上述的彈性散射部分。但在散射光譜中，在入射光的頻率附近還存在許多強度很弱的譜線。它們構成喇曼振動光譜。這是因為入射光的電場迫使大分子中的電子、原子核及帶電基團位移。這種位移的能力稱為大分子的極化率 α，它隨分子的轉動和振動作週期性的變化。α變化的頻率決定喇曼譜線的頻移，變化的大小決定譜線的強度。另一情況是當入射線的頻率接近或等於大分子中某個髮色基團吸收帶的頻率時，振動躍遷與電子躍遷同時發生。這時大分子發出的散射光稱為共振喇曼散射。它的強度比一般的喇曼散射強得多。

生物大分子的喇曼光譜即它的振動光譜。生物大分子中的易極化基團如碳－碳雙鍵（－C＝C－）及二硫鍵(－S－S－) 等具有很強的喇曼譜線;球狀蛋白質的α-螺旋和β－摺疊層可以從喇曼譜線中識別；生物大分子的骨架構型也有特徵的譜線形式；甚至組分複雜的噬菌體也能給出分辨清楚的喇曼譜線。因此喇曼光譜可以用來研究生物大分子的結構。另外，振動光譜對大分子構象變化的響應極其靈敏，也可由喇曼譜線的變化研究生物大分子構象的變化。例如DNA、RNA分子的特徵譜線增強，表示它們已經變性，當大分子從晶態變成溶液時，表示構象的自由度增加，而且存在與溶劑的相互作用。

X射線及中子小角散射

小角散射的原理與大顆粒的光彈性散射相同。區別在於這個技術採用波長為 1埃左右的 X射線或中子輻射作為光源。因為生物大分子的線度比入射線的波長大得多，大部分的散射線限於接近入射線的方向，即散射分佈的角度範圍很小，所以這種技術稱為“小角散射”或“低角散射”，有時簡稱“溶液散射”。它與光散射時一樣，當外推到零散射角時，X射線或中子的散射強度與溶液濃度及分子量成正比關係，從而可以推算大分子的分子量和回轉半徑。相應的作圖法稱為吉尼爾作圖法。

在 X射線及中子小角散射中，作為背景的溶劑散射不能忽略。這種散射甚至可能淹沒溶液中大分子的散射。這種現象稱為溶劑的反差效應。選用不同溶劑可以調節反差效果。在X射線散射中常用蔗糖與鹽作為溶劑，但調節範圍不大。在中子散射中常用水與重水 (D2O)作為溶劑。由於氫與氘 (D或2H)原子對於中子的散射能力差別很大(見生物大分子衍射技術)，因此調節範圍也寬。另外，對於一種生物大分子，可以採用D-H交換的辦法改變它對中子的散射能力。由於各種生物大分子對於中子的散射能力也各不相同，因此對於一個多組分的生物大分子的複合體顆粒，可以採用改變溶劑的比例(H2O/D2O)並結合氘氫交換的辦法，使得某些組分反差加強，另外一些反差減弱，從而可以確定這些組分的區域分佈。應用這個技術已經測定了一些病毒、脂蛋白、核蛋白體、核小體以及一些與染色質有關的結構。

參考書目

nstein，r，Methods of Experimentalphysics，Vol.20，Biophysics，Academic Press，New York，1982.